Подводные камни проточной цитометрии в диагностической гематопатологии

Аннотация

Проточная цитометрия (ФК) оказалась чрезвычайно универсальным и полезным инструментом для диагностики и мониторинга гематологических заболеваний в дополнение ко многим другим применениям. Значительные достижения в области электроники, программного обеспечения и реагентов за последние годы упростили некоторые аспекты ФК, в то же время способность комбинировать 8–10 антител в одной пробирке может создать как технические, так и интерпретационные проблемы, которые труднее обнаружить при использовании только 3–4 цветовых комбинаций. Использование многопараметрических панелей может облегчить идентификацию аномальных популяций; Однако характеристики опухолевого населения могут создавать потенциальные диагностические ошибки. Понимание нормальных иммунофенотипических паттернов в состоянии покоя, восстановления, и активация является критическим первым шагом для того, чтобы надлежащим образом идентифицировать аномальные популяции, которые характеризуют гематопоэтические новообразования. Кроме того, внедрение новых терапевтических стратегий, в частности таргетной терапии, может смешивать стандартные методы анализа данных проточной цитометрии, и знание влияния терапии на данные проточной цитометрии имеет решающее значение для точной интерпретации данных. В этой рукописи будут рассмотрены вопросы доаналитического анализа, инструментов и интерпретации, которые могут привести к неправильной интерпретации результатов.

1. ВВЕДЕНИЕ
Проточная цитометрия (ПЦ) использовалась более 30 лет в диагностике и мониторинге кроветворных новообразований (Barlogie et al., 1980 ; Bernstein, Andrews, Cohen & McMaster, 1982 ; Straus et al., 1979 ). Первоначальные исследования проводились с одиночными антителами или комбинациями двойных антител, ограничивая чувствительность для обнаружения небольших аберрантных популяций. В связи с постоянно растущей доступностью новых флуорохромов и тандемных красителей в настоящее время легко проводится рутинный клинический анализ с 8–10 + антителами в одной пробирке (Hedley, Keeney, Popma, & Chin-Yee, 2015 ; Rajab, Axler, Leung, Возняк и Порвит, 2017 ; Ван Донген и др., 2012 ; Вуд, 2006). В то время как периферическая кровь и костный мозг являются основными типами образцов, обычно анализируемыми с помощью ПЦ, практически любая ткань, которая может быть превращена в суспензию отдельных клеток, а также различные жидкости организма, например, спинномозговая жидкость (CSF), плевральная жидкость и асцит, также могут быть окрашены и проанализированы. В этой статье мы рассмотрим преаналитические, аналитические и интерпретационные вопросы, которые обычно наблюдаются при обработке и интерпретации данных проточной цитометрии.

2 ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

Образцы, полученные для ПЦ, должны быть проверены на наличие признаков плохого обращения после сбора. Например, свернутые или гемолизированные образцы могут не отражать исследуемого состояния заболевания. Образцы, загрязненные периферической кровью, показывают увеличенное количество зрелых гранулоцитов, и это должно быть отмечено в окончательном отчете. Жизнеспособность часто вызывает беспокойство, когда образцы ткани собирают, и по этой причине их следует помещать в консервирующую среду [например, среду 199 или среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640] сразу после сбора. Все образцы должны быть оценены на жизнеспособность. В большинстве лабораторий график прямого рассеяния в зависимости от бокового рассеяния (SSC) используется для исключения мусора и получения грубой оценки жизнеспособности. Один метод, используемый в некоторых лабораторных условиях, в частности, при оценке образцов тканей следует включать в анализ образцов жизнеспособный краситель (например, 7AAD или амино-реактивные флуоресцентные красители). Такие красители могут быть добавлены к образцу и проанализированы с помощью FC, чтобы обеспечить точную оценку качества исследуемого материала. Образцы тканей, отправляемые в реферальные лаборатории, часто могут извлечь выгоду из использования флуоресцентных красителей жизнеспособности, поскольку дегенеративные клетки могут быть трудно исключить только с помощью рассеяния света. Преимущества такого удаления достигаются за счет уменьшения максимального количества антигенов, доступных для данной пробирки. Лаборатория, обрабатывающая только периферическую кровь из собственного учреждения, может посчитать использование красителя жизнеспособности менее важным, чем региональная или национальная референс-лаборатория, которая получила большое количество образцов ткани. Как правило, образцы либо промывают, окрашивают, и затем добавляют буфер для лизиса, или образцы можно окрашивать, лизировать и затем промывать. Для обнаружения поверхностного иммуноглобулина важно, чтобы образцы были промыты минимум два раза в физиологическом растворе с фосфатным буфером перед окрашиванием для удаления цитофильных антител. фигураНа фиг.1 показано влияние увеличения степени промывки на отделение поверхностного окрашивания каппа и лямбда в образце крови. В случаях, когда встречаются необычные или неожиданные схемы окрашивания, промывка для удаления компонентов плазмы может улучшить качество данных. Кроме того, некоторые клоны антител могут быть более восприимчивыми к таким взаимодействиям (Wood & Levin, 2006 ).

 

Рисунок 1

Неправильная отмывка. На всех графиках показаны все CD19-позитивные клетки из образца костного мозга. Улучшение связывания сигнала с шумом антител легкой цепи с увеличением предварительной промывки образца. Промывку осуществляли с 0,3% альбумина в забуференном солевом растворе. Количество отмывок увеличивается слева направо до окрашивания; (а) не мыть; (б) одна отмывка; (в) две отмывки; (г) три отмывки; и (д) три отмывки и 10 минут блокирования с 5% альбумина

Некоторые образцы могут демонстрировать устойчивость к лизису эритроцитов (RBC) в зависимости от болезненного состояния пациентов или лекарственной терапии (Kasinrerk, 2003 ). Рисунок 2 иллюстрирует образец, который можно увидеть, когда образцы несоответствующим образом лизируются. Нагревание образца во время инкубации в лизирующем агенте может увеличить лизис эритроцитов. Кроме того, встряхивание образца может усилить лизис эритроцитов.

фигура 2

Слабый лизис эритроцитов. Пример плохого лизиса эритроцитов на образце периферической крови, окрашенном на CD45 и CD3. CD3-позитивные лимфоциты показаны синим цветом, все остальные лимфоциты окрашены в красный цвет, моноциты окрашены в оранжевый цвет, а гранулоциты показаны в фиолетовый. (а) Используемый краситель жизнеспособности показывает почти 100% жизнеспособности. Исправляемый флуоресцентный краситель жизнеспособности, используемый в этом анализе, реагирует с клеточными аминами и не может проникать через мембраны живых клеток. Они действительно реагируют с белками клеточной поверхности и приводят к тусклому окрашиванию живых клеток. Если краситель становится внутриклеточным, он может окрашивать как внутренние, так и внешние амины, что приводит к более интенсивному окрашиванию мертвых или отмирающих клеток. (б) Анализ рассеяния света показывает большую популяцию клеток. (c) Боковое рассеяние в сравнении с CD45 показывает только 16% пятен образца для CD45.

Традиционно антитела сначала добавляют в окрашивающую пробирку, а затем образец помещают в пробирку. Если это не сделать осторожно, может быть часть образца, которая плохо смешивается с антителом. Это также можно наблюдать не только в применениях белых кровяных клеток, но и в применениях эритроцитов, например, при тестировании клеток с дефицитом гликозилфосфатидилинозитола (GPI) при пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ). В условиях тестирования на ПНГ это может привести к тому, что популяция будет ошибочно классифицирована как содержащая дефицитные по GPI клетки, когда на самом деле клетки нормальные (Sutherland, Keeney, & Illingworth, 2012 ). Рисунок 3выделяет типичную картину ПЦ, когда возникает такая ситуация. Обратите внимание, что клетки, по-видимому, имеют два уровня окрашивания, один, как и ожидалось, а второй с уменьшенной экспрессией (рис. 3 а). Рисунок 3 б показана установка повтора одного и тот же образец с осторожностью , чтобы гарантировать , как кровь и антитела находятся в нижней части трубы без каких — либо эритроцитов на стенке трубы.

Рисунок 3

Неполное окрашивание. В этом примере показано влияние неполного окрашивания образца и его влияние на интерпретацию. (а) Клетки имеют два уровня экспрессии CD59, но снижают экспрессию CD235a. (b) Повторение того же образца, показывающее, что тусклая популяция CD59 больше не присутствует и является результатом неполного окрашивания

Еще одной проблемной областью является проблема расщепления антител-красителей. Это может происходить с некоторыми тандемными красителями, например, APC-Alexa 750 или PE-Cyanine 5.5. Когда это происходит, продукт возвращается к исходному флуорохрому, то есть аллофикоцианину (APC) или фикоэритрину (PE). Это имеет эффект отрицательного поверхностного маркера в канале PE или APC, который выглядит положительным, как показано на рисунке 4 . На левой панели показан результат с расщеплением антител от APC-Alexa 750 к APC, при этом воздействие CD2-позитивных Т-клеток ложно представляется положительным для CD34. На правой панели показан этот образец, содержащий новую партию антител. Защита антител от прямого света, хранение в темных бутылках и извлечение их из холодильника в течение минимального времени, необходимого для подготовки образца, ограничит это разрушение.

Рисунок 4

Тандемный распад красителя. В этом случае APC-Alexa750 (конъюгированный с анти-CD2) сломался и был записан в детекторе APC. CD2-положительные Т-клетки выделены пурпурным цветом на (а) и зеленым на (б). (a) Этот пример показывает ложный сигнал в канале APC, создающий ложное впечатление, что CD2-позитивные Т-клетки экспрессируют CD34 (анти-CD34 был конъюгирован с APC в этом эксперименте). (б) Тот же образец повторяли с новым флаконом анти-CD2 APC-Alexa750. В этом примере CD2-позитивная популяция Т-клеток присутствует, но не выявлена ​​популяция, совместно экспрессирующая CD34 и CD2.

Когда антитела поставляются в предварительно смешанном коктейле, который был проверен, мало беспокоит то, что неправильное антитело могло быть добавлено в окрашивающую пробирку. Однако, если антитела добавляются по отдельности, всегда существует вероятность того, что будет добавлено неправильное антитело или флуорохром. Это может быть трудно обнаружить, особенно в многоцветных многослойных ситуациях. Всякий раз, когда отмечается неожиданное окрашивание популяции, следует рассмотреть эту возможность. Проверка окрашивания всех популяций в выборке часто позволяет обнаружить эту проблему. Рисунок 5показывает пример, где правильное антитело (CD5), но неправильный флуорохром (PE-Cy5) было добавлено к образцу, что привело к ложной CD34-позитивной экспрессии на лимфоцитах. Ложная экспрессия CD34, наблюдаемое в этом примере, связано с тем, что между PE-Cy5 и APC требуется существенная коррекция перелива, которая не требовалась при использовании предполагаемого флуорохрома.

Рисунок 5

Неправильное антитело флуорохром используется в настройке. На этом рисунке показана панель с CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD34 и CD45. (а) На всех графиках показаны яркие лимфоциты с низким боковым рассеиванием (SSC) CD45. (б) Присутствующие клетки являются преимущественно CD3-позитивными клетками (окрашены в синий цвет). (c) CD3-позитивные Т-клетки кажутся зрелыми и большинство экспрессируют либо CD4, либо CD8. (d) CD5 PC5.5 был показан в протоколе, используемом на приборе, но фактическим реагентом, использованным в панели, был CD5 PC5. (д) Синие CD3-позитивные клетки, по-видимому, коэкспрессируют CD2 и CD34. (f) Синие CD3-позитивные клетки также, по-видимому, коэкспрессируют CD7 и CD34. Эти данные не имеют смысла, так как зрелые Т-клетки должны быть CD34-отрицательными. Использование антитела PC5 на панели вызывает ложноположительный сигнал в канале APC, который в данном случае является CD34 APC. Этот сигнал присутствует, потому что величина компенсации, необходимая для PE-Cy5, намного выше, чем требуется для PE-Cy5.5. Это под компенсацией антитела приводит к ложноположительному сигналу, наблюдаемому в APC.

3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

Важно, чтобы перед тестированием образцов пациентов проточный цитометр был оптимально выровнен, трубки фотоумножителя были настроены для оптимального обнаружения сигнала, и выполнялась компенсация прибора, чтобы исключить появление нежелательного сигнала в канале, отличном от конкретного интересующего канала. Это достаточно простая проблема в 2 или 3 цветных окрасках; однако в 8–10 цветных окрасках это становится слишком сложным, чтобы делать это вручную, и требует, чтобы компьютерные алгоритмы отслеживали множественные области перекрытия сигналов. Рисунок 6a иллюстрирует значительный потенциал для неправильного сообщения о ненормальной популяции B-клеток с ограниченной легкой цепью, основанной на яркой экспрессии лямбда-PE, вызывающей ложно-положительное окрашивание (CD10 PE Texas Red) целевой популяции. Компенсация между двумя каналами установлена ​​на уровне 72%. На рис. 6, б показан тот же образец с корректной компенсацией (увеличение компенсации на 1%). Обратите внимание, что «положительная» популяция теперь показана отрицательной, и у пациента есть поликлональные В-клетки.

Рисунок 6

Плохая компенсация. На этом рисунке представлен пример того, что может произойти, если яркий антиген помечен флуорохромом рядом с флуорохромом другого ключевого антигена с примененной некорректной компенсацией. (а) В выборке показана популяция (окрашенная в черный цвет), которая представляет собой CD19 + CD10 + и преимущественно лямбда + с соотношением каппа к лямбде 9: 1. При изучении графиков CD10 в сравнении с CD19 и каппа в сравнении с лямбда, эти результаты указывают на лямбду, экспрессирующую CD10-позитивную популяцию В-клеток, что поднимает вопрос о В-клеточном новообразовании. Однако при изучении графика зависимости лямбды от CD10 становится ясно, что клетки, экспрессирующие яркую лямбда-легкую цепь, некорректно кажутся CD10-положительными из-за перетекания из PE в канал PE-Texas Red. Обратите внимание на диагональную форму населения, которая дает ключ к неуместной компенсации. (б) Когда образец правильно компенсирован, В-клетки выглядят политипическими. Как показано на последних точечных графиках на каждой панели, появление CD10 на клетках, экспрессирующих лямбда-легкие цепи, было вторичным по отношению к недостаточной компенсации

Все современные проточные цитометры позволяют собирать «время» в качестве параметра. Это очень полезно в ситуациях, когда поток пробы может быть прерван (например, пузырьками в трубке) или когда образец высохнет. Если ввести «время», то область, в которой виден разрыв потока или конец цикла, можно легко исключить или «закрыть», чтобы оставить только те части анализа, которые не были затронуты нарушением потока. Рисунок 7a, b показывает влияние стробирования по временному параметру на образец костного мозга, который высыхает примерно через 400 с. Левый ряд графиков показывает значительные «осколки» как рассеяния света, так и флуоресценции. Когда временной интервал (верхний правый график) перемещается, чтобы исключить всплеск событий, а затем падение, данные из начальной части цикла сохраняются. Параметр номера события также может быть использован таким образом.

Рисунок 7

Влияние параметра времени. Графики зависимости времени от количества используются для определения того, был ли и когда поток был прерван во время сбора данных. Изучение первых гистограмм в (а) и (б) показывает, что сбор данных был прерван примерно через 400 с. (а) точечные графики показывают все события; (б) точечные графики показывают только события, собранные во время стабильного сбора данных (см. временные гейты на гистограммах). Воздействие можно увидеть на точечных графиках прямого рассеяния в зависимости от бокового рассеяния и CD45 в зависимости от бокового рассеяния. Обратите внимание, что отсутствие большого количества мусора и CD45-негативных популяций, наблюдаемых после того, как временные гейты были скорректированы, чтобы включать в себя только события, записанные во время стабильного сбора данных

Многие образцы содержат клеточные дублеты. Они могут быть увеличены в недостаточно дезагрегированных образцах ткани и в некоторых В-клеточных злокачественных опухолях и могут быть увеличены, когда используются более высокие скорости потока. Проточный цитометр может обнаруживать дублеты на основе различий в рассеивании света, где дублеты могут иметь ту же общую флуоресценцию, что и большая ячейка, амплитуда сигнала будет отличаться между ними, как и время полета (TOF). Посредством построения графика прямой рассеяния в зависимости от прямой амплитуды (высоты) или TOF довольно легко обнаружить и исключить дублеты из анализа. На рисунке 8a показан пример, в котором дублеты могут создавать аномальную популяцию, экспрессирующую CD19 и CD5 (Keeney, Hedley, & Chin-Yee, 2017). После удаления дублета популяция, экспрессирующая CD19 и CD5, больше не присутствует (рис. 8, б).

Рисунок 8

Дублеты, вызывающие появление ненормальной популяции. (а) Показан пример, в котором дублеты могут создавать аномальную популяцию, экспрессирующую как CD19, так и CD5 (окрашены в черный цвет). (b) После удаления дублета явно существует CD5-положительная популяция (синяя) и CD19-положительная (красная), которые разделены, но популяция дублетов, демонстрирующая явную экспрессию CD5 и CD19 (вероятно, дублетов В-клеток и Т ячеек) больше нет

При работе с образцами с очень небольшим количеством ячеек, например, CSF, или при выполнении минимального остаточного обнаружения (MRD), важно, чтобы прибор был чистым (например, чистящая панель или пустая пробирка должна быть запущена до образца) и чтобы не является переносом из предыдущего образца, который может выглядеть как ложноположительная популяция (Craig, Ohori, Gorrill, & Swerdlow, 2011 ).

Наконец, когда пробы запускаются на проточном цитометре, обычной практикой является использование заранее определенных протоколов с предварительно выбранными комбинациями антител, чтобы упростить анализ как во время, так и в автономном режиме после сбора данных. Если выбранный протокол не соответствует применяемым комбинациям антител и флуорохрома, существует вероятность неправильной характеристики популяции клеток. Всегда проверка образцов окрашивания остаточных нормальных популяций является одним из способов обнаружить это.

4 ВОПРОСА ИНТЕРПРЕТАЦИИ ДАННЫХ

После проверки потенциальных преаналитических и аналитических переменных для обеспечения высококачественных проточных цитометрических данных необходимо учитывать несколько факторов для достижения точной и последовательной интерпретации данных.

Основа ПЦ для распознавания гематопоэтической неоплазии основана на том принципе, что аномальные клетки, включающие гематопоэтическое новообразование, отличаются по иммунофенотипу от нормальных аналогов, что позволяет распознавать неопластические гематопоэтические клетки методом проточной цитометрии (Craig & Foon, 2008 ). Следует отметить, что иммунофенотип, связанный с нормальным кроветворением, не является статичным и характеризуется сдвигами в экспрессии антигена, которые происходят во время созревания и с различными состояниями активации (Li, Juco, Mann & Holden, 2004 ; McKenna, Washington, Aquino, Picker, & Kroft, 2001 ; van Lochem et al., 2004 ; Wood, 2016). Характер экспрессии антигена, связанный с нормальными гемопоэтическими клетками, также может варьироваться в зависимости от типа образца.

Например, при рассмотрении В-клеток нормальный костный мозг будет содержать весь спектр созревания В-клеток от самых ранних предшественников В-клеток (гематогонов), которые проходят через различные стадии созревания в костном мозге до зрелых, но наивных В-клеток, к иммуноглобулин-продуцирующим плазматическим клеткам. Напротив, в периферической крови (Perez-Andres et al., 2010), можно увидеть несколько незрелых В-клеток до рождения (они экспрессируют CD5, CD10 и CD38), но более ранние стадии созревания В-клеток не типичны. Зрелые наивные и В-клетки памяти обычно преобладают в крови, причем пропорции этих подмножеств различаются в зависимости от возраста пациента. Плазменные или иммунобласты (яркие CD38 с уменьшенным CD20) могут присутствовать в крови в небольших количествах и могут усиливаться при воспалительных состояниях. Пропорции этих различных подгрупп B-клеток колеблются в зависимости от множества факторов, включая, как отмечалось, возраст пациента и воспалительное состояние (Kaminski, Wei, Qian, Rosenberg, & Sanz, 2012). Кроме того, регенерация костного мозга, аутоиммунные заболевания и медикаменты могут влиять на пропорции различных подгрупп B-клеток в периферической крови. В реактивных лимфатических узлах и тканях с лимфоидной гиперплазией другой реактивной популяцией В-клеток, с которой часто встречаются, является реактивная фолликулярная гиперплазия, которая характеризуется экспрессией CD10 с ярким CD20, повышенной CD38 и сниженной интенсивностью, но, как правило, политипной экспрессией легкой цепи (Mantei & Wood, 2009 ). Несколько реактивных B-ячеек показаны на рисунке 9 .

Рисунок 9

Нормальные закономерности созревания лимфоидных клеток: (a – f) на всех графиках показаны все клетки CD19 + B; (a – c) нормальный костный мозг. Стрелки показывают изменения в экспрессии антигена с созреванием. Нормальный костный мозг содержит В-клетки на всех стадиях созревания, от ранних гематогонов (аква) до гематогонов промежуточной стадии (желтый), до зрелых и зрелых В-клеток, которые начали экспрессировать поверхностную легкую цепь (синий = каппа, красный = лямбда). (д, е) периферическая кровь. В отличие от костного мозга, в периферической крови, на графике CD10 против CD20, можно увидеть преимущественно зрелые В-клетки, экспрессирующие CD20 без CD10. Следует отметить, что присутствует небольшая популяция незрелых В-клеток до появления экспрессии CD10 и CD38 (красная стрелка). По сравнению с покоящимися фоновыми В-клетками, эти клетки также будут экспрессировать CD5 (данные не показаны). К тому же, отмечена небольшая популяция циркулирующих плазменных бластов (синяя стрелка). (е) Лимфатический узел. Этот реактивный лимфатический узел показывает B-клеточное подмножество, экспрессирующее CD10 и CD38, что соответствует реактивной фолликулярной гиперплазии (зеленая стрелка). (g – i) Тимусная ткань. На всех графиках показаны все Т-лимфоидные клетки. Тимусная ткань демонстрирует полный спектр созревания Т-клеток от самых незрелых Т-клеток, у которых отсутствует поверхностный CD3 (розовый), до CD4 и CD8 двойных положительных Т-клеток (желтый), до Т-клеток, экспрессирующих либо CD4, либо CD8 (красный и зеленый соответственно). Стрелки указывают на изменения в экспрессии антигена с созреванием. J-L. Периферическая кровь, все графики показывают CD3 + Т-клетки. Три общих реактивных набора Т-клеток выделены. Крупные гранулярные лимфоциты показаны зеленым и экспрессируют CD8 со слегка уменьшенным CD5; Память CD4 + T-клетки выделены красным и показывают экспрессию CD4 без CD7, а гамма-дельта-T-клетки выделены синим и показывают яркий CD3 без CD4. Это преимущественно CD8-негатив, хотя отмечается экспрессия на незначительном подмножестве

Созревание Т-клеток происходит в тимусе, поэтому ткань тимуса, с которой можно столкнуться при биопсии тимуса, гиперплазии тимуса или тимомы, покажет спектр созревания Т-клеток, включая Т-клетки, отрицательные как для CD4, так и для CD8. положительный как для CD4, так и для CD8, и отдельно положительный для каждого из этих маркеров. Т-клетки, обнаруженные в крови, костном мозге и периферических лимфоидных тканях, являются в основном зрелыми и могут включать в себя различные реактивные подгруппы Т-клеток, которые имеют характерные сдвиги в экспрессии пан-Т-клеточных антигенов. Большие гранулярные лимфоциты Т-клеток экспрессируют CD3 и CD8 с вариабельно сниженным CD5, гамма-дельта-Т-клетки экспрессируют очень яркие CD3 с уменьшенным или отсутствующим CD8, а Т-клетки памяти включают CD4-позитивные Т-клетки с пониженной экспрессией CD7. Распределение этих различных подмножеств Т-клеток может варьироваться в зависимости от анатомического сайта и состояния активации. Например, гамма-дельта-Т-клетки могут представлять более высокую долю общего количества Т-клеток в селезенке и кишечнике (в частности, в условиях локального воспалительного заболевания), чем в периферической крови или костном мозге (Ингирами, Чжу, Чесс и Ноулз,1990 ; Steenholt et al., 2017 ), тогда как Т-клетки памяти распространены в образцах кожи и плевральной жидкости (Farber, Yudanin, & Restifo, 2014 ). Различные нормальные реактивные лимфоидные подмножества показаны на рисунке 9 .

Неопластические популяции могут напоминать состояние созревания или активации, но будут демонстрировать аберрантные иммунофенотипические паттерны, отсутствующие при нормальных обстоятельствах. Экспрессия антигена может быть увеличена, уменьшена или отсутствует по сравнению с нормальным аналогом. Кроме того, аномальные популяции могут экспрессировать антиген, обычно не экспрессируемый на какой-либо стадии нормального развития (например, экспрессия нелинейного антигена или сверхэкспрессия онкогена). Таким образом, основа для интерпретации данных проточной цитометрии для идентификации кроветворных новообразований в значительной степени опирается на глубокое понимание нормальных иммунофенотипических паттернов. Рисунок 10 характеризует несколько примеров экспрессии антигена в лимфоидных новообразованиях с акцентом на то, как эти паттерны отличаются от нормальных аналогов.

Рисунок 10

Нормальные аналоги по сравнению с неопластической популяцией. На всех графиках показаны CD19 + В-клетки. Нормальные / реактивные образцы показаны слева, в то время как опухолевая популяция (светло-синяя) присутствует в образцах справа. а) нормальный костный мозг; (б) костный мозг, вовлеченный в B-лимфобластный лейкоз (B-LL). Нормальный костный мозг содержит гематогоны, которые экспрессируют CD10 и CD38 на высоких уровнях. В примере B-LL, показанном на (b), неопластические клетки показаны светло-голубым цветом и показывают яркий CD10 с низкой, переменной экспрессией CD38. Этот паттерн экспрессии CD10 и CD38 является аберрантным и не виден в нормальном костном мозге (стрелка). (в) нормальная кровь; (г) кровь, вовлеченная в хронический лимфолейкоз (ХЛЛ). Нормальная периферическая кровь может содержать популяцию реактивных CD5 + B-клеток, которые демонстрируют политипную экспрессию поверхностной легкой цепи (каппа = синий, лямбда = красный) и нормальные уровни CD20. В отличие от D) аномальные клетки, наблюдаемые при CLL, демонстрируют сильную экспрессию CD5 с аберрантно низким CD20, что позволяет легко отделиться от нормальных фоновых B-клеток. (д) Фолликулярная гиперплазия может наблюдаться в реактивных лимфатических узлах и демонстрирует экспрессию CD38 (повышенная) и CD10. (f) Напротив, опухолевые клетки при фолликулярной лимфоме демонстрируют экспрессию CD10, но с низким или отсутствующим CD38. Кроме того, фолликулярная лимфома обычно демонстрирует монотипическую экспрессию поверхностной легкой цепи, более низкую интенсивность CD19 и повышенный уровень BCL-2 по сравнению с реактивной фолликулярной гиперплазией (данные не показаны) [Цветной рисунок можно посмотреть на (д) Фолликулярная гиперплазия может наблюдаться в реактивных лимфатических узлах и демонстрирует экспрессию CD38 (повышенная) и CD10. (f) Напротив, опухолевые клетки при фолликулярной лимфоме демонстрируют экспрессию CD10, но с низким или отсутствующим CD38. Кроме того, фолликулярная лимфома обычно демонстрирует монотипическую экспрессию поверхностной легкой цепи, более низкую интенсивность CD19 и повышенный уровень BCL-2 по сравнению с реактивной фолликулярной гиперплазией (данные не показаны) [Цветной рисунок можно посмотреть на (д) Фолликулярная гиперплазия может наблюдаться в реактивных лимфатических узлах и демонстрирует экспрессию CD38 (повышенная) и CD10. (f) Напротив, опухолевые клетки при фолликулярной лимфоме демонстрируют экспрессию CD10, но с низким или отсутствующим CD38. Кроме того, фолликулярная лимфома обычно демонстрирует монотипическую экспрессию поверхностной легкой цепи, более низкую интенсивность CD19 и повышенный уровень BCL-2 по сравнению с реактивной фолликулярной гиперплазией (данные не показаны)

Поскольку популяции опухолей характеризуются аберрантными физическими и иммунофенотипическими свойствами, эти популяции могут уклоняться от типичных стратегий гейтирования. Лимфоидные гейты, основанные на прямом и SSC или CD45 против SSC свойствах, могут быть общей отправной точкой для идентификации лимфоидных популяций. Хотя эта стратегия будет эффективна при выявлении большинства лимфоидных новообразований от маленького до среднего размера, крупноклеточная лимфома (и волосатоклеточный лейкоз) может иметь улучшенные рассеивающие свойства, удаляя часть или всю опухолевую популяцию из стандартных лимфоидных гейтов (рис. 11).). Точно так же бластные гейты, определяемые CD45 и SSC, часто являются отправной точкой для выявления аномальных предшественников при оценке образца для острого лейкоза; однако, острый промиелоцитарный лейкоз, как правило, демонстрирует повышенную SSC, часто удаляя большую часть опухолевой популяции из стандартного CD45 по сравнению с SSC-определенными бластными гейтами. В таких случаях опухолевая популяция может чрезмерно гранулоцитарной популяции в проекции CD45 против SSC. Подобно тому, как физические свойства могут изменяться в опухолевых популяциях, экспрессия антигена может изменяться и мешать стандартным стратегиям стробирования. Двумя часто встречающимися примерами этого явления являются лимфобластный лейкоз / лимфома, которые могут быть отрицательными для CD45 и избегать стандартного CD45 в сравнении с SSC-определенными бластными гейтами и новообразованиями Т-клеток, который может показывать отсутствие или снижение интенсивности одного или нескольких Т-клеточных антигенов, включая в некоторых случаях CD3. Поскольку свойства разброса, CD45 и маркеры происхождения могут использоваться для стробирования, очень важно не ограничивать поиск неопластической популяции одной популяцией, а скорее оценивать данные дополнительными способами, используя более одного параметра и прогноз для идентификации населения. Например, при оценке на острый лейкоз не ограничивайте поиск предшественников или бластов CD45 в сравнении с SSC-определенными бластными гейтами, а скорее рассматривайте все клетки в образце, используя несколько маркеров, которые могут быть экспрессированы популяцией предшественников. Точно так же, хотя оценка Т-клеток может начинаться с оценки лимфоидных клеток, экспрессирующих маркеры, включая CD3,

Рисунок 11

Стратегии ограничительного гейтирования могут исключать опухолевую популяцию. Шаблоны и предопределенные гейты могут значительно улучшить рабочий процесс; однако следует избегать стратегий ограничительного гейтирования, поскольку они могут привести к исключению группы населения, представляющей интерес. Например, острая лейкемия может иногда выходить за пределы стандартного CD45 по сравнению с определяемыми боковыми точками взрыва. (а, б) На всех графиках показаны все лейкоциты. (а) В-лимфобластный лейкоз (ненормальные бласты светло-голубые), при которых бласты являются CD45-отрицательными и в значительной степени исключены из стандартного CD45-определяемого бокового рассеяния (SSC) бластного затвора. (б) Острый промиелоцитарный лейкоз (аномальные бластные эквиваленты оранжевого цвета). Взрывные эквиваленты показывают увеличение бокового рассеяния. Хотя часть взрывов присутствует в CD45 по сравнению с заданным SSC взрывным затвором, основное подмножество исключается. Оценка данных различными способами позволит полностью определить аномальную популяцию. В нижней части (а) видно, что аномальные CD45-негативные В-лимфоидные бласты экспрессируют CD19, в то время как нижняя часть (b) демонстрирует, что аномальные промиелоцитарные эквиваленты бласта демонстрируют равномерную экспрессию CD33 с низким CD45. Аналогичный принцип иллюстрируется в (с) и (г). (c) Все CD3-позитивные Т-клетки с CD4-позитивными Т-клетками красного цвета и CD8-позитивными Т-клетками зеленого цвета. Аберрантные популяции Т-клеток не идентифицируются, если фокусироваться на CD3-позитивных Т-клетках. Однако, если оценивать все лимфоидные клетки, (d) идентифицируется большая популяция ненормальных (светло-голубых) поверхностных CD3-негативных Т-клеток, которые экспрессируют CD5 без CD7 [Цветной рисунок можно посмотреть на В нижней части (а) видно, что аномальные CD45-негативные В-лимфоидные бласты экспрессируют CD19, в то время как нижняя часть (b) демонстрирует, что аномальные промиелоцитарные эквиваленты бласта демонстрируют равномерную экспрессию CD33 с низким CD45. Аналогичный принцип иллюстрируется в (с) и (г). (c) Все CD3-позитивные Т-клетки с CD4-позитивными Т-клетками красного цвета и CD8-позитивными Т-клетками зеленого цвета. Аберрантные популяции Т-клеток не идентифицируются, если фокусироваться на CD3-позитивных Т-клетках. Однако, если оценивать все лимфоидные клетки, (d) идентифицируется большая популяция ненормальных (светло-голубых) поверхностных CD3-негативных Т-клеток, которые экспрессируют CD5 без CD7 [Цветной рисунок можно посмотреть на В нижней части (а) видно, что аномальные CD45-негативные В-лимфоидные бласты экспрессируют CD19, в то время как нижняя часть (b) демонстрирует, что аномальные промиелоцитарные эквиваленты бласта демонстрируют равномерную экспрессию CD33 с низким CD45. Аналогичный принцип иллюстрируется в (с) и (г). (c) Все CD3-позитивные Т-клетки с CD4-позитивными Т-клетками красного цвета и CD8-позитивными Т-клетками зеленого цвета. Аберрантные популяции Т-клеток не идентифицируются, если фокусироваться на CD3-позитивных Т-клетках. Однако, если оценивать все лимфоидные клетки, (d) идентифицируется большая популяция ненормальных (светло-голубых) поверхностных CD3-негативных Т-клеток, которые экспрессируют CD5 без CD7 [Цветной рисунок можно посмотреть на Можно видеть, что аномальные CD45-негативные B-лимфоидные бласты экспрессируют CD19, в то время как нижняя часть (b) демонстрирует, что аномальные промиелоцитарные эквиваленты бласта демонстрируют равномерную экспрессию CD33 с низким CD45. Аналогичный принцип иллюстрируется в (с) и (г). (c) Все CD3-позитивные Т-клетки с CD4-позитивными Т-клетками красного цвета и CD8-позитивными Т-клетками зеленого цвета. Аберрантные популяции Т-клеток не идентифицируются, если фокусироваться на CD3-позитивных Т-клетках. Однако, если оценивать все лимфоидные клетки, (d) идентифицируется большая популяция ненормальных (светло-голубых) поверхностных CD3-негативных Т-клеток, которые экспрессируют CD5 без CD7 [Цветной рисунок можно посмотреть на Можно видеть, что аномальные CD45-негативные B-лимфоидные бласты экспрессируют CD19, в то время как нижняя часть (b) демонстрирует, что аномальные промиелоцитарные эквиваленты бласта демонстрируют равномерную экспрессию CD33 с низким CD45. Аналогичный принцип иллюстрируется в (с) и (г). (c) Все CD3-позитивные Т-клетки с CD4-позитивными Т-клетками красного цвета и CD8-позитивными Т-клетками зеленого цвета. Аберрантные популяции Т-клеток не идентифицируются, если фокусироваться на CD3-позитивных Т-клетках. Однако, если оценивать все лимфоидные клетки, (d) идентифицируется большая популяция ненормальных (светло-голубых) поверхностных CD3-негативных Т-клеток, которые экспрессируют CD5 без CD7 [Цветной рисунок можно посмотреть на Аберрантные популяции Т-клеток не идентифицируются, если фокусироваться на CD3-позитивных Т-клетках. Однако, если оценивать все лимфоидные клетки, (d) идентифицируется большая популяция ненормальных (светло-голубых) поверхностных CD3-негативных Т-клеток, которые экспрессируют CD5 без CD7 [Цветной рисунок можно посмотреть на Аберрантные популяции Т-клеток не идентифицируются, если фокусироваться на CD3-позитивных Т-клетках. Однако, если оценивать все лимфоидные клетки, (d) идентифицируется большая популяция ненормальных (светло-голубых) поверхностных CD3-негативных Т-клеток, которые экспрессируют CD5 без CD7

В то время как идентификация аномальной популяции с помощью ПЦ часто является критическим этапом при определении того, вовлечен ли образец в новообразование; данные проточной цитометрии должны рассматриваться в соответствующем клиническом и морфологическом контексте, чтобы установить точный диагноз в большинстве случаев. Существует, например, несколько обстоятельств, при которых можно идентифицировать иммунофенотипически аберрантную популяцию лимфоцитов, которая не представляет лимфому. Например, монотипические, но реактивные популяции В-клеток или Т-клеток могут наблюдаться в воспалительных состояниях. Что касается В-клеток, фолликулярная гиперплазия редко описывается как перекошенная или монотипическая форма легкой цепи (Kussick, Kalnoski, Braziel & Wood, 2004). Аналогично, реактивные клоны Т-клеток были описаны при различных воспалительных состояниях или в условиях хронической антигенной стимуляции. В некоторых случаях такие популяции Т-клеток могут даже демонстрировать паттерны экспрессии антигена, которые классически можно считать ненормальными. Например, в условиях хронической антигенной стимуляции, вызванной цитомегаловирусом (ЦМВ), можно увидеть CD4-позитивные Т-клетки, которые коэкспрессируют CD8 низкого уровня с CD56 и демонстрируют клон Т-клеток (Rodriguez-Caballero et al., 2008). В дополнение к таким реактивным популяциям можно наблюдать небольшие клональные популяции в периферической крови или тканях, которые имеют иммунофенотипические признаки, отражающие лимфоидное новообразование, но с морфологическими и клиническими признаками, которые не позволяют четко поставить диагноз лимфомы или лейкемии. Несколько таких объектов были определены Всемирной организацией здравоохранения и включают моноклональный В-клеточный лимфоцитоз, частота которого увеличивается с возрастом и чаще всего демонстрирует иммунофенотип, перекрывающийся с хроническим лимфоцитарным лейкозом / малым лимфоцитарным лейкозом, а также фолликулярной неоплазией in situ и мантией in situ. клеточная неоплазия, которая показывает перекрывающиеся иммунофенотипические признаки с фолликулярной лимфомой и мантийно-клеточной лимфомой соответственно (Nardi, Kuo, & Hasserjian, 2019 ; Swerdlow et al., 2017). Корреляция данных проточной цитометрии с клиническими и морфологическими данными позволит отделить реактивную, но монотипическую популяцию, моноклональный В-клеточный лимфоцитоз и неоплазию in situ от явной лимфомы или лейкемии.

Дополнительным предостережением, которое следует учитывать при интерпретации данных проточной цитометрии, является наблюдение, что негематопоэтические новообразования могут иногда экспрессировать гематопоэтические маркеры. Например, CD56 обычно экспрессируется в солидных опухолях, происходящих из эпителия (Chu, Arber, & Weiss, 2003 ). Поскольку в некоторых случаях при негематопоэтических новообразованиях можно наблюдать экспрессию одного или нескольких гематопоэтических антигенов, следует проявлять осторожность при интерпретации данных, а данные проточной цитометрии следует рассматривать в соответствующем клиническом и морфологическом контексте.

Важно признать, что нормальные паттерны не являются статичными и могут изменить настройку терапии. Способ изменения экспрессии антигена зависит от типа проводимой терапии и временного интервала с момента самой последней терапии. По этой причине крайне важно интерпретировать данные проточной цитометрии в соответствующем терапевтическом контексте. Например, традиционные химиотерапевтические схемы лечения острого лейкоза могут привести к неспецифическому уничтожению быстро делящихся клеток, что приводит к панцитопении и общему снижению клеточности образцов, таких как костный мозг или кровь, в дни и недели после терапии. В зависимости от интенсивности проводимой терапии можно увидеть различия в количестве и качестве нормальных регенерирующих популяций предшественников в разные моменты времени (Рисунок 12). Таргетная терапия обычно используется отдельно или в комбинации при различных гематопоэтических новообразованиях. Нормальные паттерны, встречающиеся у пациентов, получающих целевую терапию, могут сильно отличаться от паттернов регенерации костного мозга в условиях обычной терапии. Рисунок 12 иллюстрирует паттерны, наблюдаемые у пациентов с B-LL, которые получали различные целевые терапии. Такая целевая терапия не только изменяет паттерны нормальных фоновых клеток, но также может изменять иммунофенотип опухолевой популяции (рис. 13).). Часто встречающееся явление — потеря целевого антигена в опухолевой популяции. Это может иметь значение для выявления остаточных заболеваний. Например, CD19 экспрессируется на большинстве нормальных В-клеток на всех стадиях созревания, а также на большинстве незрелых и зрелых новообразований В-клеток. Эта особенность обычно делает CD19 и отличным стробирующим реагентом для идентификации как нормальных популяций B-клеток, так и новообразований B-клеток. Однако полезность этого реагента снижается при назначении методов лечения, нацеленных на этот антиген, так как рецидивы после терапии могут быть CD19-отрицательными.

Рисунок 12

Терапия может изменить внешний вид нормальной популяции. Спектр иммунофенотипов, определяющих нормальное созревание, может изменяться под влиянием терапии. Рассмотрим гематогоны. На всех графиках показаны CD19-позитивные клетки в образце костного мозга. CD19-позитивные В-клетки показаны зеленым цветом, а плазматические клетки (если присутствуют) показаны синим цветом. (a, b) Точечные графики из того же образца, которые демонстрируют полный спектр созревания B-клеток от ранних гематогонов до зрелых B-клеток. (c) Этот образец показывает CD19 + B-клетки от пациента после терапии B-лимфобластного лейкоза, у которого нет признаков остаточного заболевания. Присутствующие предшественники В-клеток демонстрируют значительный сдвиг влево при созревании В-клеток с преобладанием гематогонов на ранней стадии. (d) В этом образце показаны CD19 + B-клетки, полученные от пациента после терапии В-лимфобластного лейкоза с использованием схемы, включающей анти-CD20 терапию. Никакой экспрессии CD20 не наблюдается ни в одной из В-клеток в этом образце. Никаких признаков остаточной болезни нет. (д) CD19-позитивные клетки от пациента, который получил анти-CD38 терапию. Обратите внимание, что гематогоны кажутся CD38 отрицательными при оценке проекции CD10 по сравнению с CD38; сравните с (b) выше, в котором показана типичная картина CD10 по сравнению с CD38 на гематогонах. При обычных обстоятельствах гематогоны должны быть CD38-положительными, а потеря или пониженная экспрессия этого маркера является аберранцией, обычно наблюдаемой в аномальных популяциях B-лимфоидных бластов. Однако, когда оценивают другие проекции (f), такие как CD10 против CD20, наблюдается нормальная экспрессия антигенов. Дополнительно, когда оценивают все события из этого образца (данные не показаны), CD38 отрицателен для всех клеточных популяций, совместим с анти-CD38 терапией. Обратите внимание, что в этом образце нет CD38-позитивных плазматических клеток

Рисунок 13

Влияние таргетной терапии на иммунофенотип опухолевой популяции. Все графики взяты у пациента с историей В-лимфобластного лейкоза. Неопластические клетки были CD19-положительными при постановке диагноза. В настоящее время пациент проходит анти-CD19-терапию и проходит обследование на предмет остаточного заболевания после терапии. (a – c) Точечные диаграммы в верхнем ряду показывают CD19 + B-клетки. Некоторые нормальные CD19-позитивные гематогоны присутствуют в этом образце и показаны зеленым цветом. Очень небольшая популяция В-клеточных предшественников демонстрирует яркую экспрессию CD10 (показана красным). (d, f) При рассмотрении всех мононуклеарных клеток в этом же образце выявляется большая популяция CD19-негативных аномальных взрывов (выделены красным), которые экспрессируют яркий CD10 с аберрантно низким CD38 и CD45.

Наконец, в условиях высокочувствительных анализов со сбором большого количества событий, а также в ситуациях, когда стратегии гейтирования изменяются, можно найти «новые группы населения», которые являются нормальными, но не видны при использовании знакомых стратегий гейтирования и когда меньшее количество события собраны. Один пример этого встречается при использовании CD45 против SSC-определенных доменных гейтов для идентификации предшественников. В то время как многие популяции бластов попадают в этот регион, другие популяции занимают «бластные гейты», которые не являются прародителями. Например, плазмоцитоидные дендритные клетки и базофилы занимают типичные CD45-определяемые SSC «бластные гейты». Эти популяции могут не быть легко идентифицированы, когда существует пропорционально большая популяция предшественников и / или относительно меньшее количество событий собрано. В настройках MRD, когда собирается большое количество событий, такие популяции становятся более очевидными и их не следует принимать за аномальные взрывы. Такие группы населения должны быть специально определены, чтобы избежать ошибочной идентификации как взрывов. В случае плазмоцитоидных дендритных клеток и базофилов обе популяции являются строго положительными в отношении CD123, что позволяет уверенно отделяться от нормальных и аномальных предшественников в большинстве случаев (рис.14 а). Включение реагентов для конкретной идентификации таких популяций желательно при рассмотрении конструкции панели. При сборе большого количества событий, как в случае MRD, можно встретить необычные паттерны экспрессии антигена, которые могут запутать анализ. Например, было описано, что небольшая часть естественных клеток-киллеров (NK) экспрессирует CD19 или CD117 низкого уровня (Montaldo et al., 2013 ; Soma et al., 2015)). Хотя это открытие не представляет проблемы в стандартном анализе, NK-клетки, экспрессирующие CD19 или CD117, могут мешать анализу MRD в условиях B-LL или острого миелоидного лейкоза соответственно. Наконец, изменения в стратегии гейтирования могут иногда выявлять новые, ранее непризнанные, нормальные группы населения. Один из примеров этого явления показан на рисунке 14 d – f. В этом примере переход от использования CD19 для идентификации B-клеток к использованию стратегии, использующей комбинацию экспрессии CD22 или CD24 (Cherian et al., 2018 ), привел к идентификации дополнительных CD34-позитивных предшественников, у которых отсутствовал CD19 и которые следует различать из CD19- отрицательных аберрантных групп населения.

Рисунок 14

Сбор большого количества событий или модификаций анализа может привести к нормальной фоновой популяции, что ранее не оценивалось. При сборе адекватных событий для тестирования минимального остаточного заболевания (MRD) станут очевидными группы населения, не собранные при сборе меньшего числа событий. (a) Точечный график, показывающий ячейки внутри CD45, в зависимости от бокового рассеяния (SSC), определяемого взрывным затвором. CD34-позитивные клетки выделены красным. Хотя популяции-предшественники обычно занимают CD45 по сравнению с определяемыми SSC бластными гейтами, многие другие популяции также могут присутствовать в этих гейтах. Полезно идентифицировать такие популяции при поиске небольших аномальных популяций взрыва, например, при настройке обнаружения MRD, чтобы не ошибочно принять их за аномальные взрывы. Две популяции, обычно встречающиеся в CD45, в сравнении с SSC-определенными бластными гейтами, включают базофилы и плазмоцитоидные дендритные клетки. Они могут быть конкретно идентифицированы с использованием CD123, маркера, экспрессируемого на высоких уровнях в обеих популяциях. Базофилы (фиолетового цвета) лишены HLA-DR, в то время как плазмоцитоидные дендритные клетки (аква) экспрессируют высокие уровни этого маркера, что позволяет отделить и идентифицировать эти две популяции из CD34-позитивных миелоидных предшественников (выделено красным). (б, в) На графиках показаны все CD19-позитивные клетки. CD19 является антигеном, экспрессия которого обычно ограничена линией В-клеток. При сборе большого количества клеток, как в случае обнаружения MRD, было установлено, что подмножество NK-клеток может экспрессировать CD19. На этих точечных графиках NK-клетки окрашены в синий цвет, тогда как истинные зрелые B-клетки окрашены в розовый цвет. (d – f) Как отмечено, пациенты, получающие анти-CD19 терапию, могут потерять экспрессию CD19 в опухолевой популяции. В таких случаях могут быть рассмотрены альтернативные методы стробирования для выявления аномальной популяции. На всех графиках показаны гейты, включая клетки, экспрессирующие CD22 или CD24 без CD66b, стратегию гейтирования, полезную для выявления аномальных бластов у пациентов с B-лимфобластным лейкозом после анти-CD19-терапии. Когда стандартная стратегия стробирования изменяется, важно отметить, что представленные группы населения также могут быть изменены. В дополнение к типичным CD19-позитивным популяциям предшественников, эта стратегия стробирования также включает CD19-негативные популяции предшественников (выделены зеленым цветом), которые экспрессируют CD22 и CD34 с вариабельным CD10 и яркие CD38 без CD24.

5. ВЫВОДЫ

ПЦ является мощным инструментом для характеристики кроветворных клеток и играет важную роль в диагностике и классификации многих гематопоэтических новообразований, а также некоторых неопухолевых состояний. Полное понимание потенциальных ловушек, которые могут возникнуть на доаналитической и аналитической стадиях, включая подготовку образцов, сбор данных и интерпретацию данных, является критическим элементом, необходимым для получения высококачественных данных проточной цитометрии.